Anaranjado de acridina

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  • Principio
El Anaranjado de Acridina (https://es.wikipedia.org/wiki/Acridina) pertenece al grupo de los colorantes de acridina.

 El naranja de acridina (o N,N,N',N'-tetrametilacridina según IUPAC) es un colorante catiónico selectivo para los ácidos nucleicos y útil para realizar determinaciones sobre el ciclo celular. Interracciona con el ADN y el ARN por intercalación dentro de la molécula o por atracción electrostática, respectivamente.

Se usa como colorante fluorescente para diferenciar ADN y ARN. Existen además numerosos procedimientos de tinción para visualizar estructuras ricas en ADN y ARN.

Se puede usar también para tinción de microorganismos en muestras no fijadas y para tinciones vitales.
  • Preparaciones
Preparación 1.

 Fórmula:
Anaranjado de Acridina 0,1 g/L
Tampón Acetato, pH 3.6 0,5M, en disolución acuosa.
Procedimiento:
1.    Preparar un frotis de la muestra a teñir en un porta limpio. 
2.    Dejar secar al aire. 
3.    Fijar el frotis con metanol al 100 % durante 1 ó 2 min. 
4.    Escurrir el metanol en exceso y dejar secar el frotis. 
5.    Cubrir el porta con el colorante Anaranjado de Acridina durante 2 min. 
6.    Enjuagar completamente con agua del grifo y dejar secar. 
7.    Los frotis se pueden examinar inicialmente a un aumento de 100X a 400X, utilizando un microscopio de fluorescencia. 
8.    Los resultados deben ser confirmados mediante examen a 1000 X, con un objetivo de inmersión. 


Preparación 2.
Anaranjado de acridina cloruro de cinc sal doble (C.I.46005) para microscopía Certistain®.

Solución tampón de fosfatos pH 6 
Solución primaria A - tampón de dihidrogenofosfato potásico 0,1 M Para preparar aprox. 1000 ml de solución se añaden juntos: 

Potasio dihidrogenofosfato 
13,61 g 
Agua destilada 
1000 ml 
disolver 
Solución primaria B - tampón de di-sodio hidrogenofosfato dihidrato 0,1 M Para preparar aprox. 1000 ml de solución se añaden juntos: 

di-Sodio hidrogenofosfato dihidrato 
17,80 g 
Agua destilada 
1000 ml 
disolver 

Solución tampón de fosfatos pH 6 
Mezclar 8,5 partes de la solución primaria A con 1,5 partes de la solución primaria B y filtre. 

Solución de anaranjado de acridina 
Para preparar aprox. 100 ml de solución se añaden juntos: 

Anaranjado de acridina cloruro de cinc sal doble (C.I.46005) Certistain® 
0,1 g 
Agua destilada 
100 ml 
disolver y filtre 

La solución de colorante recién preparada debe filtrarse antes de su uso. 

Solución de trabajo de anaranjado de acridina 
Para preparar aprox. 100 ml de solución se añaden juntos: 

Solución de anaranjado de acridina 
10 ml 
Agua destilada 
90 ml 
mezclar 
Solución de ácido acético al 1 % 
Para preparar aprox. 100 ml de solución se añaden juntos: 

Ácido acético 100% 
1 ml 
Agua destilada 
99 ml 
mezclar 
Solución diferenciadora de cloruro cálcico al 11 % 
Para preparar aprox. 100 ml de solución se añaden juntos: 

Calcio cloruro 
1,1 g 
Agua destilada 
100 ml 
disolver 
Procedimiento:

Los portaobjetos deberían ser escurridos bien por goteo después de los diferentes pasos de tinción, de esta manera se podrá evitar el innecesario arrastre de soluciones.

 Para conseguir un óptimo resultado de tinción, deberían respetarse los períodos indicados. 

Portaobjetos con frotis fijado 
Etanol 100 % 
1 minuto 
Etanol 95 % 
1 minuto 
Etanol 80 % 
1 minuto 
Etanol 70 % 
1 minuto 
Agua destilada 
1 minuto 
Solución de ácido acético 1 % 
enjuagar brevemente 
Agua destilada 
enjuagar 
Solución tampón de fosfatos pH 6 
2 minutos 
Solución de trabajo de anaranjado de acridina 
3 minutos* 
Dejar que se escorra el colorante en exceso 
Solución tampón de fosfatos pH 6 
2 minutos 
Solución tampón de fosfatos pH 6 
2 minutos 
Incluir en tampón de fosfatos con un cubreobjetos, bordear (con laca para uñas incolora),
examinar al microscopio inmediatamente 

* Diferenciar con solución de cloruro de calcio al 11 % si los núcleos celulares muestran fluorescencia poco nítida. 

Para el análisis de preparados teñidos con un aumento microscópico >40x se recomienda el uso de aceite de inmersión. 


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