Extracción y separación de pigmentos fotosintéticos sin productos perjudiciales para la salud: Cromatografía plana "en capa fina"
Para realizar la separación de los distintos pigmentos fotosintéticos vamos a utilizar un método físico denominado Cromatografía plana "en capa fina".
Se trata de una técnica analítica cualitativa que consiste en separar los diferentes componentes de una mezcla compleja, con el fin de identificar los distintos componentes de esta.
Se basa en la retención selectiva, de tal modo que se observa el diferente comportamiento de los componentes de una mezcla sobre un soporte (fase estacionaria), dicha superficie puede ser un gas, un papel, un líquido o una resina. Cada uno de los componentes tendrá una velocidad de retención diferente, lo que hará que se vayan separando, permitiendo así su identificación. Por lo tanto, será importante la capacidad de adsorción de cada mezcla que permitirá que las partículas sean retenidas sobre la superficie. Vamos a conseguir la separación de los distintos componentes (pigmentos) al tener una afinidad diferente en la mezcla.
Fases de la cromatografía:
Los componentes que se han de separa (pigmentos) se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (fase estacionaria) mientras que la otra (fase móvil) se mueve en una dirección definida, en nuestro caso en sentido ascendente.
Pigmentos a analizar:
En la cromatografía realizada, al introducir el papel de filtro en la mezcla de disolvente y los pigmentos, se arrastra con distinta velocidad según la solubilidad que tengan y los separa, permitiendo identificarlos perfectamente según el color obtenido. De tal modo que tendríamos:
PIGMENTO COLOR
Clorofila A Verde azulado
Clorofila B Verde amarillento
Carotenos Naranja
Xantofilas Amarillo
Materiales:
· Material que analizar: Spirulina sp., Chlorella vulgaris y Petroselinum sp.
· Alcohol etílico 96º (actuará como fase móvil).
· Papel de filtro cualitativo de velocidad media (actuará como fase estacionaria).
· Vaso de precipitados 100 ml.
· Caja de Petri.
Realización de la cromatografía:
1. Disolver las muestras
- Disolver todas las muestras que se desea analizar: Spirulina sp., Chlorella vulgaris y Petroselinum sp.) en pequeños vasos de precipitados (100 ml) utilizando el alcohol etílico 96º (actuará como fase móvil).
Fig.1. Dilución de las muestras en alcohol etílico
- Si se desea conservar las muestras para un análisis posterior se colocarán en botellas con tapa para minimizar la evaporación del alcohol. La concentración óptima para realizar la cromatografía será de 10 gramos de muestra en 100 ml de alcohol).
Fig.2. Conservación muestras
- Etiquetar cada uno de los vasos de precipitados con la muestra a analizar.
Fig.3. Etiquetado muestras
2. Preparar la cámara y fase estacionaria
- Coger una caja de Petri de un diámetro de 80 cm. Utilizaremos para cada análisis una de las partes, de tal modo que con una caja podremos realizar dos cromatografías. Dado que el alcohol sube rápidamente por el papel filtro no es necesario tener una cámara cerrada para evitar que los vapores del alcohol se evaporen (si el alcohol se evaporara rápidamente el movimiento se detendría). Si esto ocurriera se debería cambiar la cámara, usando una cámara de cromatografía con tapa (de este modo con la evaporación del alcohol la cámara se mantendría saturada de vapores y permitiría el escalado del alcohol por el papel filtro).
- Cortar la parte inferior del papel de filtro cualitativo de velocidad media que actuará como fase estacionaria. Realizar un doblado vertical al papel. De este modo se podrá apoyar directamente sobre la caja de Petri.
- Etiquetar cada una de las cajas de Petri con la muestra a analizar.
3. Realizar la cromatografía
- Agregar la muestra a analizar previamente preparada en la caja de Petri, aproximadamente se debe llenar la mitad de esta.
- Fig.4. Muestras a analizar (inicio)
- Colocar el papel de filtro sobre la muestra para permitir que eluya y no volver a tocarlo hasta que termine la cromatografía. A medida que la muestra se mueve hacia arriba sobre el papel filtro, éste aparecerá transparente y húmedo. La elución llevará un tiempo relativamente corto (10-15 minutos).
Fig.5. Muestras a analizar (tras 15 minutos)
- Etiquetar cada uno de los papeles filtro con la muestra analizada con un lápiz, ya que el grafito del lápiz se mantendrá en el tiempo.
Fig.6.
Spirulina sp. (15 minutos)
Fig.7.
Spirulina sp. (seco)
Fig.8. Chlorella vulgaris
(15 minutos)
Fig.9. Chlorella vulgaris (seco)
Fig. 10. Petroselinum sp. (15 minutos)
Fig. 11. Petroselinum sp. (seco)
4. Registrar la cromatografía
- Se puede escanear, fotografiar o registrar electrónicamente las cromatografías realizadas desarrolladas, pero es mucho más fácil y pedagógico copiar una imagen de la cromatografía a mano en el cuaderno de laboratorio o cuaderno de trabajo de la asignatura. Es importante copiar el papel de filtro “a escala”, es decir, las dimensiones deben ser las mismas en el cuaderno que en la realidad.
- Para ello, el papel de cromatografía (una vez seco) se puede colocar encima de la página del cuaderno y hacer una representación junto a ella. Será importante copiar la cromatografía con el mayor detalle posible, dibujando las manchas exactamente como aparecen. En dicho boceto se anotará los datos utilizados para realizar la cromatografía (muestra analizada, concentración de muestra, fase móvil utilizada, tiempo transcurrido y manchas detectadas (apariencia inicial ya que algunas manchas pueden cambiar de color con el tiempo).
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